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Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. ​

文献信息 ​

DOI10.1002/(SICI)1097-0061(199807)14:10<953::AID-YEA293>3.0.CO;2-U
PMID9717241
期刊Yeast (Chichester, England)
影响因子2.6
JCR 分区Q3
发表年份1998
被引次数3492
关键词PCR介导技术, 基因删除, 酵母基因组, 模块化质粒, 基因功能分析
文献类型Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't, Research Support, U.S. Gov't, P.H.S.
ISSN0749-503X
页码953-61
期号14(10)
作者M S Longtine, A McKenzie, D J Demarini, N G Shah, A Wach, A Brachat, P Philippsen, J R Pringle

一句话小结 ​

本研究开发了一种一步法PCR介导的染色体基因缺失和修饰技术，能够快速进行酿酒酵母的基因操作，而无需质粒克隆。通过模块化的质粒体系，研究实现了多种基因修饰，显著提高了基因功能分析的效率和经济性，为酿酒酵母的基因研究提供了新的工具和方法。

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PCR介导技术 · 基因删除 · 酵母基因组 · 模块化质粒 · 基因功能分析

摘要 ​

酿酒酵母基因功能分析的一个重要进展是开发了一种一步法PCR介导的染色体基因缺失和修饰技术。该方法允许在不需要感兴趣基因的质粒克隆的情况下，进行非常快速的基因操作。我们在此描述了一组新的质粒，它们作为PCR合成片段的模板，允许多种基因修饰。使用酿酒酵母TRP1基因或包含异源的裂殖酵母his5+或大肠杆菌kan(r)基因的模块作为选择标记，这些质粒可以实现基因缺失、基因过表达（使用可调控的GAL1启动子）、C端或N端蛋白标记（使用GFP(S65T)、GST或3HA或13Myc表位）以及部分N端或C端缺失（有或没有伴随的蛋白标记）。由于这些质粒的模块化特性，它们允许高效且经济地使用少量PCR引物进行多种基因操作。因此，这些质粒应进一步促进酿酒酵母中基因功能的快速分析。

英文摘要 ​

An important recent advance in the functional analysis of Saccharomyces cerevisiae genes is the development of the one-step PCR-mediated technique for deletion and modification of chromosomal genes. This method allows very rapid gene manipulations without requiring plasmid clones of the gene of interest. We describe here a new set of plasmids that serve as templates for the PCR synthesis of fragments that allow a variety of gene modifications. Using as selectable marker the S. cerevisiae TRP1 gene or modules containing the heterologous Schizosaccharomyces pombe his5+ or Escherichia coli kan(r) gene, these plasmids allow gene deletion, gene overexpression (using the regulatable GAL1 promoter), C- or N-terminal protein tagging [with GFP(S65T), GST, or the 3HA or 13Myc epitope], and partial N- or C-terminal deletions (with or without concomitant protein tagging). Because of the modular nature of the plasmids, they allow efficient and economical use of a small number of PCR primers for a wide variety of gene manipulations. Thus, these plasmids should further facilitate the rapid analysis of gene function in S. cerevisiae.

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主要研究问题 ​

  1. 在使用PCR介导的基因删除和修饰技术时，如何选择合适的可选择标记基因？
  2. 这种模块化质粒系统如何与其他基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）进行比较？
  3. 除了S. cerevisiae，还有哪些其他真核生物可以使用类似的PCR技术进行基因修改？
  4. 该技术在基因功能分析中的应用范围和局限性是什么？
  5. 如何优化PCR引物的设计，以提高基因操作的效率和准确性？

核心洞察 ​

  1. 研究背景和目的
    近年来，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因的功能分析取得了显著进展，其中一项关键技术是单步PCR介导的基因缺失和修饰方法。这种方法的优势在于能够快速进行基因操作，而无需依赖感兴趣基因的质粒克隆。研究的目的是开发一套新的质粒模板，以支持多种基因修改的PCR合成片段，从而进一步推动酿酒酵母中基因功能的快速分析。

  2. 主要方法和发现
    本研究介绍了一组新的质粒，这些质粒作为PCR合成片段的模板，能够实现多种基因修改。这些质粒使用了酿酒酵母TRP1基因或异源的Schizosaccharomyces pombe his5+基因和大肠杆菌kan(r)基因作为选择标记。通过这些质粒，研究者可以进行基因缺失、基因过表达（采用可调节的GAL1启动子）、C端或N端蛋白标记（包括GFP(S65T)、GST或3HA、13Myc表位），以及部分N端或C端缺失（可有可无的伴随蛋白标记）。由于这些质粒具有模块化特性，研究者可以使用少量PCR引物高效且经济地进行多种基因操作。

  3. 核心结论
    本研究成功开发了一套模块化质粒，显著简化了针对酿酒酵母的基因缺失和修饰的实验流程。这种方法的灵活性和高效性使得科学家能够在短时间内进行多样化的基因操作，推动了基因功能的快速分析。

  4. 研究意义和影响
    该研究的成果为酿酒酵母的功能基因组学提供了强有力的工具，能够加速基因功能的解析。通过简化操作流程和降低资源消耗，这一技术的推广将有助于更多研究者在酿酒酵母中开展基因功能研究，进而推动生物技术、合成生物学等领域的发展。此外，该方法的模块化设计也为其他微生物的基因工程提供了宝贵的借鉴，具有广泛的应用潜力。

引用本文的文献 ​

  1. The Src homology domain 3 (SH3) of a yeast type I myosin, Myo5p, binds to verprolin and is required for targeting to sites of actin polarization. - B L Anderson;I Boldogh;M Evangelista;C Boone;L A Greene;L A Pon - The Journal of cell biology (1998)
  2. Involvement of an actomyosin contractile ring in Saccharomyces cerevisiae cytokinesis. - E Bi;P Maddox;D J Lew;E D Salmon;J N McMillan;E Yeh;J R Pringle - The Journal of cell biology (1998)
  3. Role of the yeast Gin4p protein kinase in septin assembly and the relationship between septin assembly and septin function. - M S Longtine;H Fares;J R Pringle - The Journal of cell biology (1998)
  4. Oxidative stress-induced destruction of the yeast C-type cyclin Ume3p requires phosphatidylinositol-specific phospholipase C and the 26S proteasome. - K F Cooper;M J Mallory;R Strich - Molecular and cellular biology (1999)
  5. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. - J M Galan;M Peter - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1999)
  6. Nuclear export of Far1p in response to pheromones requires the export receptor Msn5p/Ste21p. - M Blondel;P M Alepuz;L S Huang;S Shaham;G Ammerer;M Peter - Genes & development (1999)
  7. The morphogenesis checkpoint in Saccharomyces cerevisiae: cell cycle control of Swe1p degradation by Hsl1p and Hsl7p. - J N McMillan;M S Longtine;R A Sia;C L Theesfeld;E S Bardes;J R Pringle;D J Lew - Molecular and cellular biology (1999)
  8. High-efficiency gene targeting in Schizosaccharomyces pombe using a modular, PCR-based approach with long tracts of flanking homology. - M D Krawchuk;W P Wahls - Yeast (Chichester, England) (1999)
  9. Mammalian Cdk5 is a functional homologue of the budding yeast Pho85 cyclin-dependent protein kinase. - D Huang;G Patrick;J Moffat;L H Tsai;B Andrews - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1999)
  10. Essential function of the polo box of Cdc5 in subcellular localization and induction of cytokinetic structures. - S Song;T Z Grenfell;S Garfield;R L Erikson;K S Lee - Molecular and cellular biology (2000)

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