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Monitoring autochthonous lung tumors induced by somatic CRISPR gene editing in mice using a secreted luciferase. ​

文献信息 ​

DOI10.1186/s12943-022-01661-2
PMID36192757
期刊Molecular cancer
影响因子33.9
JCR 分区Q1
发表年份2022
被引次数1
关键词腺病毒, 自生小鼠肿瘤, CRISPR, 荧光素酶, 肺癌
文献类型Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't
ISSN1476-4598
页码191
期号21(1)
作者Nastasja Merle, Sabrina Elmshäuser, Florian Strassheimer, Michael Wanzel, Alexander M König, Julianne Funk, Michelle Neumann, Katharina Kochhan, Frederik Helmprobst, Axel Pagenstecher, Andrea Nist, Marco Mernberger, André Schneider, Thomas Braun, Tilman Borggrefe, Rajkumar Savai, Oleg Timofeev, Thorsten Stiewe

一句话小结 ​

本研究开发了一种新的报告小鼠，通过表达荧光素酶GLuc，实现了对自生肿瘤生长的快速、精准监测，克服了传统成像技术的局限。该方法能够在小体积血样中定量肿瘤负荷，为临床前研究提供了一种经济高效、动物友好的疾病监测工具。

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腺病毒 · 自生小鼠肿瘤 · CRISPR · 荧光素酶 · 肺癌

摘要 ​

背景
体内基因编辑的体细胞使用CRISPR核酸酶，促进了自生小鼠肿瘤的产生，这些肿瘤由与人类疾病相关的基因改变引发，并沿着与患者相似的自然时间线发展。然而，内脏器官中肿瘤的生长过程漫长且变化多端，这需要复杂、耗时且资源密集的成像技术来进行纵向疾病监测，从而阻碍了自生肿瘤模型在临床前研究中的应用。

方法
为了促进更广泛的应用，我们生成了一种报告小鼠，该小鼠表达来自高雅海葵（Gaussia princeps）的Cre诱导型荧光素酶（GLuc），该酶在细胞中通过消耗能量的过程分泌，并且可以在血液中定量测量，作为可存活肿瘤负荷的标记。此外，我们开发了一种灵活的、互补的工具包，以快速组装重组腺病毒（AVs），用于同时传递Cre重组酶和针对癌症驱动基因的CRISPR核酸酶。

结果
我们证明，使用CRISPR-AVs对GLuc报告小鼠进行气管内感染，能够有效诱导由靶向癌症基因突变驱动的肺肿瘤，并同时激活GLuc转基因，导致生长中的肿瘤将GLuc分泌到血液中。GLuc在血液中的水平可以在小体积的血样中通过廉价设备轻松而可靠地定量，能够在人道研究终点之前数月内实现肿瘤检测，并精准反映由诱导基因组合指定的肿瘤发展动力学。

结论
我们的研究确立了基于血液的GLuc监测作为一种廉价、快速、高通量且动物友好的方法，以在临床前研究中纵向监测自生肿瘤的生长。

英文摘要 ​

BACKGROUND In vivo gene editing of somatic cells with CRISPR nucleases has facilitated the generation of autochthonous mouse tumors, which are initiated by genetic alterations relevant to the human disease and progress along a natural timeline as in patients. However, the long and variable, orthotopic tumor growth in inner organs requires sophisticated, time-consuming and resource-intensive imaging for longitudinal disease monitoring and impedes the use of autochthonous tumor models for preclinical studies.

METHODS To facilitate a more widespread use, we have generated a reporter mouse that expresses a Cre-inducible luciferase from Gaussia princeps (GLuc), which is secreted by cells in an energy-consuming process and can be measured quantitatively in the blood as a marker for the viable tumor load. In addition, we have developed a flexible, complementary toolkit to rapidly assemble recombinant adenoviruses (AVs) for delivering Cre recombinase together with CRISPR nucleases targeting cancer driver genes.

RESULTS We demonstrate that intratracheal infection of GLuc reporter mice with CRISPR-AVs efficiently induces lung tumors driven by mutations in the targeted cancer genes and simultaneously activates the GLuc transgene, resulting in GLuc secretion into the blood by the growing tumor. GLuc blood levels are easily and robustly quantified in small-volume blood samples with inexpensive equipment, enable tumor detection already several months before the humane study endpoint and precisely mirror the kinetics of tumor development specified by the inducing gene combination.

CONCLUSIONS Our study establishes blood-based GLuc monitoring as an inexpensive, rapid, high-throughput and animal-friendly method to longitudinally monitor autochthonous tumor growth in preclinical studies.

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主要研究问题 ​

  1. 在使用GLuc监测肺肿瘤的过程中，如何确保肿瘤生长的精确时间与基因编辑的关系？
  2. 该研究中使用的重组腺病毒（AVs）在其他类型的癌症模型中是否同样有效？
  3. GLuc血液监测方法与传统的成像技术相比，具体有哪些优势和局限性？
  4. 如何优化GLuc的表达系统以提高其在不同肿瘤模型中的监测灵敏度？
  5. 在未来的研究中，如何结合其他生物标志物来进一步提高肿瘤监测的准确性和可靠性？

核心洞察 ​

研究背景和目的 ​

本研究旨在探讨不同基因敲除小鼠模型在特定条件下的生存率及其相关性，特别关注C.Cre、PR.Cre和PRL.Cre小鼠的生存时间。研究意图为理解这些基因对小鼠生存的影响，并为后续的生物医学研究提供数据支持。

主要方法/材料/实验设计 ​

研究采用了小鼠模型，通过基因敲除技术构建不同的实验组。具体实验设计如下：

Mermaid diagram
  • 小鼠模型构建：选用C.Cre、PR.Cre和PRL.Cre小鼠，分别进行基因敲除。
  • 生存时间记录：记录各组小鼠在特定条件下的生存天数。
  • 数据分析：使用统计学方法分析生存数据，计算生存率和显著性。

关键结果和发现 ​

  • C.Cre小鼠的生存时间为325天，PR.Cre小鼠为196天，PRL.Cre小鼠的生存时间未定义。
  • 统计结果显示C.Cre小鼠的生存率显著高于PR.Cre小鼠（P<0.0001），而PR.Cre小鼠的生存率也显著高于PRL.Cre小鼠（P=0.0067）。
  • 生存率的变化呈现出不同基因对小鼠生存的显著影响。
小鼠组生存时间（天）P值
C.Cre325<0.0001
PR.Cre1960.0067
PRL.Cre未定义-

主要结论/意义/创新性 ​

本研究表明，C.Cre小鼠在特定条件下表现出更高的生存率，提示C.Cre基因可能在小鼠的生存机制中发挥了重要作用。这一发现为理解基因与生存之间的关系提供了新的视角，并可能为相关疾病的研究和治疗提供新的靶点。

研究局限性和未来方向 ​

  • 局限性：本研究样本量较小，且PRL.Cre小鼠的生存时间未能定义，可能影响结果的全面性和准确性。
  • 未来方向：建议扩大样本量，进一步探索其他相关基因对小鼠生存的影响，同时可考虑将研究范围扩展至其他动物模型，以验证结果的普适性。

参考文献 ​

  1. Implementation of CRISPR/Cas9 Genome Editing to Generate Murine Lung Cancer Models That Depict the Mutational Landscape of Human Disease. - Oliver Hartmann;Michaela Reissland;Carina R Maier;Thomas Fischer;Cristian Prieto-Garcia;Apoorva Baluapuri;Jessica Schwarz;Werner Schmitz;Martin Garrido-Rodriguez;Nikolett Pahor;Clare C Davies;Florian Bassermann;Amir Orian;Elmar Wolf;Almut Schulze;Marco A Calzado;Mathias T Rosenfeldt;Markus E Diefenbacher - Frontiers in cell and developmental biology (2021)
  2. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. - Isabel J Hildebrandt;Helen Su;Wolfgang A Weber - ILAR journal (2008)
  3. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. - Thomas Wurdinger;Christian Badr;Lisa Pike;Ruben de Kleine;Ralph Weissleder;Xandra O Breakefield;Bakhos A Tannous - Nature methods (2008)
  4. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. - Xiaoshu Xu;Augustine Chemparathy;Leiping Zeng;Hannah R Kempton;Stephen Shang;Muneaki Nakamura;Lei S Qi - Molecular cell (2021)
  5. Mutant p53 promotes tumor progression and metastasis by the endoplasmic reticulum UDPase ENTPD5. - Fotini Vogiatzi;Dominique T Brandt;Jean Schneikert;Jeannette Fuchs;Katharina Grikscheit;Michael Wanzel;Evangelos Pavlakis;Joël P Charles;Oleg Timofeev;Andrea Nist;Marco Mernberger;Eva J Kantelhardt;Udo Siebolts;Frank Bartel;Ralf Jacob;Ariane Rath;Roland Moll;Robert Grosse;Thorsten Stiewe - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2016)
  6. Loss of p130 accelerates tumor development in a mouse model for human small-cell lung carcinoma. - Bethany E Schaffer;Kwon-Sik Park;Gloria Yiu;Jamie F Conklin;Chenwei Lin;Deborah L Burkhart;Anthony N Karnezis;E Alejandro Sweet-Cordero;Julien Sage - Cancer research (2010)
  7. CRISPR/Cas9 delivery with one single adenoviral vector devoid of all viral genes. - Eric Ehrke-Schulz;Maren Schiwon;Theo Leitner;Stephan Dávid;Thorsten Bergmann;Jing Liu;Anja Ehrhardt - Scientific reports (2017)
  8. Immune evasion before tumour invasion in early lung squamous carcinogenesis. - Céline Mascaux;Mihaela Angelova;Angela Vasaturo;Jennifer Beane;Kahkeshan Hijazi;Geraldine Anthoine;Bénédicte Buttard;Françoise Rothe;Karen Willard-Gallo;Annick Haller;Vincent Ninane;Arsène Burny;Jean-Paul Sculier;Avi Spira;Jérôme Galon - Nature (2019)
  9. Challenges in the quest for 'clean meat'. - Lieven Thorrez;Herman Vandenburgh - Nature biotechnology (2019)
  10. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. - F Ann Ran;Le Cong;Winston X Yan;David A Scott;Jonathan S Gootenberg;Andrea J Kriz;Bernd Zetsche;Ophir Shalem;Xuebing Wu;Kira S Makarova;Eugene V Koonin;Phillip A Sharp;Feng Zhang - Nature (2015)

引用本文的文献 ​

  1. Mutant p53-ENTPD5 control of the calnexin/calreticulin cycle: a druggable target for inhibiting integrin-α5-driven metastasis. - Evangelos Pavlakis;Michelle Neumann;Nastasja Merle;Ronja Wieboldt;Michael Wanzel;Viviane Ponath;Elke Pogge von Strandmann;Sabrina Elmshäuser;Thorsten Stiewe - Journal of experimental & clinical cancer research : CR (2023)

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