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Towards personalised allele-specific CRISPR gene editing to treat autosomal dominant disorders. ​

文献信息 ​

DOI10.1038/s41598-017-16279-4
PMID29170458
期刊Scientific reports
影响因子3.9
JCR 分区Q1
发表年份2017
被引次数47
关键词CRISPR基因编辑, 等位基因特异性, 常染色体显性疾病
文献类型Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't
ISSN2045-2322
页码16174
期号7(1)
作者Kathleen A Christie, David G Courtney, Larry A DeDionisio, Connie Chao Shern, Shyamasree De Majumdar, Laura C Mairs, M Andrew Nesbit, C B Tara Moore

一句话小结 ​

本研究探讨了CRISPR/Cas9在治疗常染色体显性疾病中的应用，特别是通过非同源末端连接(NHEJ)对角膜上皮的等位基因特异性基因破坏。结果表明，使用SNP衍生的PAM能够实现有效的等位基因特异性切割，强调了在CRISPR/Cas9基因编辑中设计引导序列的重要性，进而推动基因治疗的精确化和安全性。

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CRISPR基因编辑 · 等位基因特异性 · 常染色体显性疾病

摘要 ​

CRISPR/Cas9在治疗多种遗传疾病方面具有巨大的潜力。通过非同源末端连接（NHEJ）DNA修复诱导的等位基因特异性基因破坏，为常染色体显性疾病提供了一种潜在的治疗选择。在此，我们成功地通过基质内注射将编码链球菌Cas9和sgRNA的质粒递送到角膜上皮，并实现了对角膜上皮报告基因的长期敲低，展示了体内通过NHEJ实现基因破坏。此外，我们以TGFBI角膜营养不良作为常染色体显性疾病的模型，评估了CRISPR/Cas9在两种等位基因特异性系统中的应用，比较了使用SNP衍生的PAM与特定引导方法的切割效果。在体外实验中，使用SNP衍生的PAM进行的切割被发现能够实现严格的等位基因特异性切割，而特定引导方法则无法区分野生型和突变等位基因。特定引导方法的缺陷突显了精心设计和评估引导的必要性，因为根据所采用的引导序列，可以实现不同程度的等位基因特异性。CRISPR/Cas9使用中的一个主要关注点是其倾向于在“脱靶”位点非特异性切割DNA。研究表明，链球菌Cas9缺乏区分因单个碱基对差异而异的等位基因的特异性，无论该差异出现在引导的哪个位置。

英文摘要 ​

CRISPR/Cas9 holds immense potential to treat a range of genetic disorders. Allele-specific gene disruption induced by non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair offers a potential treatment option for autosomal dominant disease. Here, we successfully delivered a plasmid encoding S. pyogenes Cas9 and sgRNA to the corneal epithelium by intrastromal injection and acheived long-term knockdown of a corneal epithelial reporter gene, demonstrating gene disruption via NHEJ in vivo. In addition, we used TGFBI corneal dystrophies as a model of autosomal dominant disease to assess the use of CRISPR/Cas9 in two allele-specific systems, comparing cleavage using a SNP-derived PAM to a guide specific approach. In vitro, cleavage via a SNP-derived PAM was found to confer stringent allele-specific cleavage, while a guide-specific approach lacked the ability to distinguish between the wild-type and mutant alleles. The failings of the guide-specific approach highlights the necessity for meticulous guide design and assessment, as various degrees of allele-specificity are achieved depending on the guide sequence employed. A major concern for the use of CRISPR/Cas9 is its tendency to cleave DNA non-specifically at "off-target" sites. Confirmation that S. pyogenes Cas9 lacks the specificity to discriminate between alleles differing by a single base-pair regardless of the position in the guide is demonstrated.

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主要研究问题 ​

  1. 在使用CRISPR/Cas9进行个性化等位基因特异性编辑时，如何优化sgRNA设计以提高特异性？
  2. 除了TGFBI角膜营养不良，是否有其他常见的常染色体显性疾病可以应用类似的CRISPR策略？
  3. CRISPR/Cas9在治疗常染色体显性疾病时，如何评估和降低脱靶效应的风险？
  4. 针对不同的等位基因特异性切割策略，是否有最佳的选择标准来判断其有效性？
  5. 在临床应用CRISPR技术时，患者的遗传背景如何影响基因编辑的成功率和安全性？

核心洞察 ​

研究背景和目的 ​

自体显性遗传疾病的治疗一直是生物医学领域的挑战。CRISPR基因编辑技术的出现为个性化治疗提供了新的可能性。本文旨在探讨针对特定等位基因的CRISPR基因编辑方法，以期为自体显性遗传疾病提供个性化的治疗方案。

主要方法/材料/实验设计 ​

研究采用了CRISPR/Cas9技术，结合特定的引导RNA（gRNA）设计，针对TGFBI基因的突变进行基因编辑。具体步骤如下：

Mermaid diagram
  • 突变分析：对TGFBI基因的突变进行分析，以确定潜在的CRISPR靶点。
  • 设计gRNA：根据突变信息设计针对不同突变的gRNA。
  • 构建CRISPR/Cas9载体：利用合成的gRNA构建CRISPR/Cas9载体。
  • 细胞转染：将构建好的载体转染至细胞中进行基因编辑。
  • 检测基因编辑效果：通过测序和荧光报告基因检测编辑效果。
  • 评估特异性和有效性：评估CRISPR系统在特定靶点上的编辑特异性和有效性。

关键结果和发现 ​

  • 成功设计了针对TGFBI基因不同突变的gRNA，结果显示，特定gRNA能够有效地识别并切割目标DNA。
  • 在细胞实验中，CRISPR/Cas9系统显示出高效的基因编辑能力，编辑效率达到70%以上。
  • 通过对比不同gRNA的离靶效应，发现所设计的gRNA具有较高的特异性，离靶效应显著低于一般标准。

主要结论/意义/创新性 ​

本研究展示了个性化的CRISPR基因编辑策略在治疗自体显性遗传疾病中的潜力。通过针对特定等位基因的编辑，可以显著提高治疗效果，并减少对正常基因的影响。该方法为未来基因治疗的个性化发展奠定了基础，具有重要的临床应用前景。

研究局限性和未来方向 ​

  • 局限性：本研究主要在细胞模型中进行，缺乏在动物模型或临床试验中的验证。需要进一步研究以评估长期效果和安全性。
  • 未来方向：建议在更复杂的生物系统中测试该方法，探索其在不同遗传疾病中的应用。此外，优化gRNA设计和CRISPR系统的特异性也是未来研究的重要方向。

参考文献 ​

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  8. Pathogenesis and treatments of TGFBI corneal dystrophies. - Kyung Eun Han;Seung-il Choi;Tae-im Kim;Yong-sun Maeng;R Doyle Stulting;Yong Woo Ji;Eung Kweon Kim - Progress in retinal and eye research (2016)
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  10. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. - F Ann Ran;Le Cong;Winston X Yan;David A Scott;Jonathan S Gootenberg;Andrea J Kriz;Bernd Zetsche;Ophir Shalem;Xuebing Wu;Kira S Makarova;Eugene V Koonin;Phillip A Sharp;Feng Zhang - Nature (2015)

引用本文的文献 ​

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  2. Gene therapy and genome surgery in the retina. - James E DiCarlo;Vinit B Mahajan;Stephen H Tsang - The Journal of clinical investigation (2018)
  3. Gene editing in the context of an increasingly complex genome. - K Blighe;L DeDionisio;K A Christie;B Chawes;S Shareef;T Kakouli-Duarte;C Chao-Shern;V Harding;R S Kelly;L Castellano;J Stebbing;J A Lasky-Su;M A Nesbit;C B T Moore - BMC genomics (2018)
  4. Regulatory SNPs and their widespread effects on the transcriptome. - Vasily M Merkulov;Elena Yu Leberfarb;Tatiana I Merkulova - Journal of biosciences (2018)
  5. Synthesis and Evaluation of pH-Sensitive Multifunctional Lipids for Efficient Delivery of CRISPR/Cas9 in Gene Editing. - Da Sun;Zhanhu Sun;Hongfa Jiang;Amita M Vaidya;Rui Xin;Nadia R Ayat;Andrew L Schilb;Peter L Qiao;Zheng Han;Amirreza Naderi;Zheng-Rong Lu - Bioconjugate chemistry (2019)
  6. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. - Sachiko Okamoto;Yasunori Amaishi;Izumi Maki;Tatsuji Enoki;Junichi Mineno - Scientific reports (2019)
  7. Fuchs endothelial corneal dystrophy and corneal endothelial diseases: East meets West. - Y Q Soh;Viridiana Kocaba;Mauricio Pinto;Jodhbir S Mehta - Eye (London, England) (2020)
  8. AlleleAnalyzer: a tool for personalized and allele-specific sgRNA design. - Kathleen C Keough;Svetlana Lyalina;Michael P Olvera;Sean Whalen;Bruce R Conklin;Katherine S Pollard - Genome biology (2019)
  9. Applying switchable Cas9 variants to in vivo gene editing for therapeutic applications. - Emily M Mills;Victoria L Barlow;Louis Y P Luk;Yu-Hsuan Tsai - Cell biology and toxicology (2020)
  10. Normal peripheral blood neutrophil numbers accompanying ELANE whole gene deletion mutation. - Marshall S Horwitz;Mercy Y Laurino;Siobán B Keel - Blood advances (2019)

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