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Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. ​

文献信息 ​

DOI10.1186/s13059-015-0823-x
PMID26612492
期刊Genome biology
影响因子9.4
JCR 分区Q1
发表年份2015
被引次数50
关键词CRISPR基因编辑, 基因功能, 实验设计, 工具与资源
文献类型Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't, Review
ISSN1474-7596
页码260
期号16()
作者Daniel B Graham, David E Root

一句话小结 ​

本研究回顾了基于CRISPR的基因组编辑实验设计中的关键考虑因素，并调查了现有的工具和资源，以支持用户有效利用该技术进行基因功能的干扰分析。该研究为研究人员提供了实用指导，有助于推动基因组编辑技术在生物医学研究中的应用。

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CRISPR基因编辑 · 基因功能 · 实验设计 · 工具与资源

摘要 ​

基于CRISPR的方法迅速成为干扰基因以揭示其功能的首选方法。在此，我们回顾了基因组编辑实验设计中的关键考虑因素，并调查了目前可用的工具和资源，以帮助使用这一技术的用户。

英文摘要 ​

CRISPR-based approaches have quickly become a favored method to perturb genes to uncover their functions. Here, we review the key considerations in the design of genome editing experiments, and survey the tools and resources currently available to assist users of this technology.

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主要研究问题 ​

  1. 在设计CRISPR基因编辑实验时，如何选择合适的靶向序列？
  2. 有哪些工具可以帮助评估CRISPR编辑的效率和特异性？
  3. 在不同类型的细胞中，CRISPR基因编辑的效果是否存在显著差异？
  4. 如何设计实验以验证CRISPR编辑对基因功能的影响？
  5. CRISPR技术在临床应用中的伦理考虑有哪些，如何在实验设计中加以应对？

核心洞察 ​

研究背景和目的 ​

CRISPR技术因其高效的基因组编辑能力迅速成为生物医学研究中的重要工具。本文旨在回顾CRISPR基因编辑实验设计中的关键考虑因素，并调查现有的工具和资源，以帮助研究人员更好地设计和实施CRISPR实验。

主要方法/材料/实验设计 ​

本文首先介绍了CRISPR-Cas9系统的基本原理，然后详细探讨了实验设计中的重要因素，包括Cas9和sgRNA的递送方法、靶点选择、sgRNA设计、编辑结果的评估等。

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关键结果和发现 ​

  1. 递送方法：CRISPR系统的递送可以通过转染或病毒转导实现。病毒转导适用于需要使用混合sgRNA池的实验。
  2. 靶点选择：选择合适的PAM序列（如NGG）和靶位点至关重要，靶位点的不同会显著影响基因敲除的效率。
  3. sgRNA设计：推荐使用多个sgRNA靶向同一基因，以提高成功率并减少偏差。
  4. 编辑结果评估：对编辑效果的确认可以通过测序、Surveyor试验等方法进行。

主要结论/意义/创新性 ​

CRISPR技术为基因功能研究提供了强有力的工具，尤其是在基因敲除和基因编辑方面。通过优化实验设计和使用现有工具，研究人员可以显著提高实验的成功率和特异性。文章还强调了对不同细胞类型中CRISPR活性的实验确认的重要性。

研究局限性和未来方向 ​

尽管CRISPR技术已经取得了显著进展，但仍存在一些局限性，包括：

  • 编辑效率：当前的编辑效率仍需改进，尤其是在同一细胞群体中获得均匀的基因编辑。
  • 偏离靶效应：尽管有多种工具可预测偏离靶效应，但这些预测的准确性仍有待提高。 未来的研究方向包括：
  • 开发更高效的Cas9变体和其他CRISPR系统。
  • 改进编辑的预测模型，以提高靶向特异性和效率。
  • 探索CRISPR在不同生物体和细胞类型中的应用潜力。

参考文献 ​

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  3. ZiFiT (Zinc Finger Targeter): an updated zinc finger engineering tool. - Jeffry D Sander;Morgan L Maeder;Deepak Reyon;Daniel F Voytas;J Keith Joung;Drena Dobbs - Nucleic acids research (2010)
  4. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. - Wolf-Dietrich Heyer;Kirk T Ehmsen;Jie Liu - Annual review of genetics (2010)
  5. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. - Martin Jinek;Krzysztof Chylinski;Ines Fonfara;Michael Hauer;Jennifer A Doudna;Emmanuelle Charpentier - Science (New York, N.Y.) (2012)
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  10. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. - Haoyi Wang;Hui Yang;Chikdu S Shivalila;Meelad M Dawlaty;Albert W Cheng;Feng Zhang;Rudolf Jaenisch - Cell (2013)

引用本文的文献 ​

  1. Genome editing: the end of the beginning. - Jennifer A Doudna;Charles A Gersbach - Genome biology (2015)
  2. A CRISPR Path to Engineering New Genetic Mouse Models for Cardiovascular Research. - Joseph M Miano;Qiuyu Martin Zhu;Charles J Lowenstein - Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology (2016)
  3. Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. - Juan C Oliveros;Mònica Franch;Daniel Tabas-Madrid;David San-León;Lluis Montoliu;Pilar Cubas;Florencio Pazos - Nucleic acids research (2016)
  4. An Overview of CRISPR-Based Tools and Their Improvements: New Opportunities in Understanding Plant-Pathogen Interactions for Better Crop Protection. - Abdellah Barakate;Jennifer Stephens - Frontiers in plant science (2016)
  5. A Broad Overview and Review of CRISPR-Cas Technology and Stem Cells. - Simon N Waddington;Riccardo Privolizzi;Rajvinder Karda;Helen C O'Neill - Current stem cell reports (2016)
  6. Gene Disruption Technologies Have the Potential to Transform Stored Product Insect Pest Control. - Lindsey C Perkin;Sherry L Adrianos;Brenda Oppert - Insects (2016)
  7. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. - Van Trung Chu;Robin Graf;Tristan Wirtz;Timm Weber;Jeremy Favret;Xun Li;Kerstin Petsch;Ngoc Tung Tran;Michael H Sieweke;Claudia Berek;Ralf Kühn;Klaus Rajewsky - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2016)
  8. CRISPR/Cas9 in zebrafish: an efficient combination for human genetic diseases modeling. - Jiaqi Liu;Yangzhong Zhou;Xiaolong Qi;Jia Chen;Weisheng Chen;Guixing Qiu;Zhihong Wu;Nan Wu - Human genetics (2017)
  9. Rapid Evolution of Manifold CRISPR Systems for Plant Genome Editing. - Levi Lowder;Aimee Malzahn;Yiping Qi - Frontiers in plant science (2016)
  10. Efficient, footprint-free human iPSC genome editing by consolidation of Cas9/CRISPR and piggyBac technologies. - Gang Wang;Luhan Yang;Dennis Grishin;Xavier Rios;Lillian Y Ye;Yong Hu;Kai Li;Donghui Zhang;George M Church;William T Pu - Nature protocols (2017)

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