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Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. ​

文献信息 ​

DOI10.1038/nbt.2501
PMID23360964
期刊Nature biotechnology
影响因子41.7
JCR 分区Q1
发表年份2013
被引次数1475
关键词基因组编辑, 斑马鱼, CRISPR-Cas系统
文献类型Journal Article, Research Support, N.I.H., Extramural, Research Support, Non-U.S. Gov't
ISSN1087-0156
页码227-9
期号31(3)
作者Woong Y Hwang, Yanfang Fu, Deepak Reyon, Morgan L Maeder, Shengdar Q Tsai, Jeffry D Sander, Randall T Peterson, J-R Joanna Yeh, J Keith Joung

一句话小结 ​

本研究探讨了细菌的CRISPR-Cas系统在斑马鱼胚胎中的靶向基因修饰能力，发现该系统能够有效引导Cas9核酸酶进行特定DNA切割，其修饰效率与传统的锌指核酸酶和转录激活因子样效应核酸酶相当。这一发现为基因编辑技术在生物体内的应用提供了新的思路，具有重要的研究意义。

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基因组编辑 · 斑马鱼 · CRISPR-Cas系统

摘要 ​

在细菌中，外源核酸通过成簇、规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）及其相关系统（Cas）被沉默。细菌的II型CRISPR系统已被改造用于生成指南RNA，从而在培养细胞中引导Cas9核酸酶进行特定位置的DNA切割。在此我们展示，CRISPR-Cas系统在体内能够有效诱导斑马鱼胚胎的靶向基因修饰，其效率与使用锌指核酸酶和转录激活因子样效应核酸酶所获得的效率相似。

英文摘要 ​

In bacteria, foreign nucleic acids are silenced by clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)--CRISPR-associated (Cas) systems. Bacterial type II CRISPR systems have been adapted to create guide RNAs that direct site-specific DNA cleavage by the Cas9 endonuclease in cultured cells. Here we show that the CRISPR-Cas system functions in vivo to induce targeted genetic modifications in zebrafish embryos with efficiencies similar to those obtained using zinc finger nucleases and transcription activator-like effector nucleases.

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主要研究问题 ​

  1. CRISPR-Cas系统在斑马鱼基因组编辑中的具体应用案例有哪些？
  2. 斑马鱼基因组编辑的效率与其他基因编辑技术相比如何？
  3. 在斑马鱼中使用CRISPR-Cas系统进行基因编辑时，存在哪些技术挑战？
  4. CRISPR-Cas系统对斑马鱼胚胎发育的潜在影响是什么？
  5. 未来CRISPR-Cas技术在斑马鱼基因组编辑中的发展趋势是什么？

核心洞察 ​

研究背景和目的 ​

CRISPR/Cas系统是细菌和古菌中进化出的防御机制，能够识别和沉默外源核酸。近期研究显示，细菌的II型CRISPR系统可以被改造为合成导向RNA（gRNA），使其能够在体外指导Cas9核酸酶进行特定DNA的切割。本研究旨在评估CRISPR/Cas系统在活体（如斑马鱼胚胎）中进行基因组编辑的有效性，并与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）进行比较。

主要方法/材料/实验设计 ​

本研究采用了以下实验设计和方法：

  1. gRNA和Cas9的构建：

    • 设计合成gRNA，包含20个与目标DNA序列互补的核苷酸。
    • 构建表达载体，允许T7 RNA聚合酶介导gRNA和Cas9的合成。

  2. RNA微注射：

    • 将gRNA和Cas9编码mRNA共注射到斑马鱼的一细胞阶段胚胎中。
    • 通过调整RNA的浓度优化编辑效率。

  3. 突变检测：

    • 使用T7内切酶I（T7EI）检测突变频率，并通过DNA测序确认突变的类型和位置。

以下是技术路线的流程图：

Mermaid diagram

关键结果和发现 ​

  • 在11个测试位点中，CRISPR/Cas系统在9个位点上成功诱导了靶向基因的插入/缺失突变，突变频率在10%到59%之间。
  • 在两个先前未能通过TALENs诱导突变的位点上，CRISPR/Cas系统表现出显著的编辑能力。
  • 所有成功诱导的突变均在预期的基因组位置上确认。

主要结论/意义/创新性 ​

CRISPR/Cas系统提供了一种简单、快速且高效的基因组编辑方法，优于传统的ZFNs和TALENs。由于仅需设计一个gRNA即可靶向特定序列，这种方法显著简化了基因组编辑的过程。此外，该技术的高效性和灵活性使其在多种生物体中具有广泛应用潜力。

研究局限性和未来方向 ​

  • 当前系统的靶向序列限制在特定的PAM序列附近，未来可研究放宽这一限制以扩展可靶向序列的范围。
  • 需进一步探索gRNA的特异性和有效性，特别是未能成功诱导突变的gRNA，了解其失败的原因。
  • 建议进行更大规模的靶向测试，并在其他生物体中验证该技术的应用。

研究总结表 ​

研究内容结果和发现
目标基因编辑9/11位点成功诱导突变，突变频率高达59%
技术优势简单、快速、高效，优于ZFNs和TALENs
未来研究方向扩展靶向序列范围，探索gRNA特异性和有效性

参考文献 ​

  1. CRISPR-based adaptive immune systems. - Michael P Terns;Rebecca M Terns - Current opinion in microbiology (2011)
  2. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. - Peng Huang;An Xiao;Mingguo Zhou;Zuoyan Zhu;Shuo Lin;Bo Zhang - Nature biotechnology (2011)
  3. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. - Fyodor D Urnov;Edward J Rebar;Michael C Holmes;H Steve Zhang;Philip D Gregory - Nature reviews. Genetics (2010)
  4. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. - Deepak Reyon;Shengdar Q Tsai;Cyd Khayter;Jennifer A Foden;Jeffry D Sander;J Keith Joung - Nature biotechnology (2012)
  5. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. - Rodolphe Barrangou;Christophe Fremaux;Hélène Deveau;Melissa Richards;Patrick Boyaval;Sylvain Moineau;Dennis A Romero;Philippe Horvath - Science (New York, N.Y.) (2007)
  6. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. - Michael Zuker - Nucleic acids research (2003)
  7. ZiFiT (Zinc Finger Targeter): an updated zinc finger engineering tool. - Jeffry D Sander;Morgan L Maeder;Deepak Reyon;Daniel F Voytas;J Keith Joung;Drena Dobbs - Nucleic acids research (2010)
  8. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. - Stan J J Brouns;Matthijs M Jore;Magnus Lundgren;Edze R Westra;Rik J H Slijkhuis;Ambrosius P L Snijders;Mark J Dickman;Kira S Makarova;Eugene V Koonin;John van der Oost - Science (New York, N.Y.) (2008)
  9. Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA). - Jeffry D Sander;Elizabeth J Dahlborg;Mathew J Goodwin;Lindsay Cade;Feng Zhang;Daniel Cifuentes;Shaun J Curtin;Jessica S Blackburn;Stacey Thibodeau-Beganny;Yiping Qi;Christopher J Pierick;Ellen Hoffman;Morgan L Maeder;Cyd Khayter;Deepak Reyon;Drena Dobbs;David M Langenau;Robert M Stupar;Antonio J Giraldez;Daniel F Voytas;Randall T Peterson;Jing-Ruey J Yeh;J Keith Joung - Nature methods (2011)
  10. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. - Martin Jinek;Krzysztof Chylinski;Ines Fonfara;Michael Hauer;Jennifer A Doudna;Emmanuelle Charpentier - Science (New York, N.Y.) (2012)

引用本文的文献 ​

  1. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. - Seung Woo Cho;Sojung Kim;Jong Min Kim;Jin-Soo Kim - Nature biotechnology (2013)
  2. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. - Yongsub Kim;Jiyeon Kweon;Annie Kim;Jae Kyung Chon;Ji Yeon Yoo;Hye Joo Kim;Sojung Kim;Choongil Lee;Euihwan Jeong;Eugene Chung;Doyoung Kim;Mi Seon Lee;Eun Mi Go;Hye Jung Song;Hwangbeom Kim;Namjin Cho;Duhee Bang;Seokjoong Kim;Jin-Soo Kim - Nature biotechnology (2013)
  3. A CRISPR way to engineer the human genome. - Sivaprakash Ramalingam;Narayana Annaluru;Srinivasan Chandrasegaran - Genome biology (2013)
  4. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. - Lei S Qi;Matthew H Larson;Luke A Gilbert;Jennifer A Doudna;Jonathan S Weissman;Adam P Arkin;Wendell A Lim - Cell (2013)
  5. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. - James E DiCarlo;Julie E Norville;Prashant Mali;Xavier Rios;John Aach;George M Church - Nucleic acids research (2013)
  6. Biotechnology: Rewriting a genome. - Emmanuelle Charpentier;Jennifer A Doudna - Nature (2013)
  7. RNA guides genome engineering. - Claudio Mussolino;Toni Cathomen - Nature biotechnology (2013)
  8. A CRISPR view of genome sequences. - Amy K Cain;Christine J Boinett - Nature reviews. Microbiology (2013)
  9. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. - Nannan Chang;Changhong Sun;Lu Gao;Dan Zhu;Xiufei Xu;Xiaojun Zhu;Jing-Wei Xiong;Jianzhong Jeff Xi - Cell research (2013)
  10. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. - Patrick R Blackburn;Jarryd M Campbell;Karl J Clark;Stephen C Ekker - Zebrafish (2013)

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