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A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. ​

文献信息 ​

DOI10.1371/journal.pone.0016765
PMID21364738
期刊PloS one
影响因子2.6
JCR 分区Q2
发表年份2011
被引次数588
关键词模块化克隆系统, 多基因构建, 合成生物学
文献类型Evaluation Study, Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't
ISSN1932-6203
页码e16765
期号6(2)
作者Ernst Weber, Carola Engler, Ramona Gruetzner, Stefan Werner, Sylvestre Marillonnet

一句话小结 ​

本研究提出了一种高效的分层模块化克隆系统，能够灵活组装复杂的真核多基因构建，克服了现有方法在DNA分子组装上的限制。通过该系统构建的33 kb DNA分子展示了其在基因叠加和代谢工程等领域的广泛应用潜力，具有重要的生物技术价值。

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模块化克隆系统 · 多基因构建 · 合成生物学

摘要 ​

合成生物学领域有望通过设计具有新颖表型的生物体来彻底改变生物技术，这些表型对医学、农业和工业具有重要价值。然而，目前方法在组装复杂的DNA分子（这些分子编码多个遗传元件并以各种预定义的排列方式组合）方面存在一定的限制因素。我们在此提出一种分层模块化克隆系统，该系统能够以高效率和随意创建任何真核多基因构建，起始于包含调控序列和编码序列的定义和验证的基本模块库。该系统基于IIS型限制酶组装多个DNA片段的能力，按照定义的线性顺序进行组装。我们构建了一个33 kb的DNA分子，包含11个转录单位，由44个单独的基本模块在仅仅三次连续克隆步骤中组成。这个模块化克隆（MoClo）系统可以方便地实现自动化，并将在基因叠加和代谢工程等应用中极为有用。

英文摘要 ​

The field of synthetic biology promises to revolutionize biotechnology through the design of organisms with novel phenotypes useful for medicine, agriculture and industry. However, a limiting factor is the ability of current methods to assemble complex DNA molecules encoding multiple genetic elements in various predefined arrangements. We present here a hierarchical modular cloning system that allows the creation at will and with high efficiency of any eukaryotic multigene construct, starting from libraries of defined and validated basic modules containing regulatory and coding sequences. This system is based on the ability of type IIS restriction enzymes to assemble multiple DNA fragments in a defined linear order. We constructed a 33 kb DNA molecule containing 11 transcription units made from 44 individual basic modules in only three successive cloning steps. This modular cloning (MoClo) system can be readily automated and will be extremely useful for applications such as gene stacking and metabolic engineering.

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主要研究问题 ​

  1. 这种模块化克隆系统在基因堆叠和代谢工程中的具体应用案例有哪些？
  2. 该系统如何与现有的DNA组装技术相比，能提供哪些优势或改进？
  3. 在构建多基因构造时，选择基本模块的标准和验证过程是怎样的？
  4. 该系统是否可以扩展到其他类型的生物体，尤其是原核生物或其他真核生物？
  5. 在自动化模块化克隆过程中，存在哪些潜在的技术挑战和解决方案？

核心洞察 ​

研究背景和目的 ​

合成生物学有望通过设计具有新表型的生物体来革新生物技术，这些生物体在医学、农业和工业中具有重要应用。然而，当前的方法在组装复杂的DNA分子方面存在局限，特别是在编码多个基因元素的情况下。本研究的目的是开发一种分层模块化克隆系统（MoClo），以高效组装任意真核多基因构建体，从预定义的基本模块库中生成。

主要方法/材料/实验设计 ​

本研究采用了一种基于IIS型限制酶的分层模块化克隆系统，该系统能够在单个反应中高效地组装多个DNA片段。具体流程如下：

Mermaid diagram
  1. 模块生成：创建五种基本模块类型，包括启动子、5'非翻译区、信号肽、编码序列和终止子（水平0模块）。
  2. 组装转录单位：利用Golden Gate克隆技术，采用BsaI限制酶将多个水平0模块组装成转录单位（水平1模块）。
  3. 组装多基因构建体：将多个水平1模块进一步组装成多基因构建体（水平2模块）。
  4. 功能验证：通过将构建体转化入植物中验证其表达功能。

关键结果和发现 ​

  • 成功构建了一个包含11个转录单位的33 kb DNA分子，使用44个基本模块，仅需三步克隆。
  • 每一步克隆反应中，获得的白色菌落（代表正确构建）数量显著高于蓝色菌落（错误构建），表明系统的高效性和准确性。
  • 实验结果表明，所有构建体均能在拟南芥中有效表达GFP，证明其功能。

主要结论/意义/创新性 ​

本研究展示的模块化克隆系统（MoClo）不仅能够高效组装复杂的多基因构建体，还具有高度的灵活性和标准化，允许研究者重用和共享基因模块。这种方法可以极大地促进合成生物学领域的研究和应用，尤其是在代谢工程和基因堆叠等方面。

研究局限性和未来方向 ​

尽管本研究展示了MoClo系统的高效性，但仍存在一些局限性：

  • 组装的构建体大小受到标准细菌宿主（如大肠杆菌）的转化能力限制。
  • 需要开发新的策略来进一步扩展构建体的复杂性。

未来的研究可以集中在优化构建体的转化效率、开发更复杂的模块和库，以支持更广泛的合成生物学应用。

参考文献 ​

  1. Towards synthesis of a minimal cell. - Anthony C Forster;George M Church - Molecular systems biology (2006)
  2. Gene synthesis demystified. - Michael J Czar;J Christopher Anderson;Joel S Bader;Jean Peccoud - Trends in biotechnology (2009)
  3. Method of artificial DNA splicing by directed ligation (SDL). - E N Lebedenko;K R Birikh;O V Plutalov; Berlin YuA - Nucleic acids research (1991)
  4. NOMAD: a versatile strategy for in vitro DNA manipulation applied to promoter analysis and vector design. - D Rebatchouk;N Daraselia;J O Narita - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1996)
  5. Pairwise selection assembly for sequence-independent construction of long-length DNA. - William J Blake;Brad A Chapman;Anuradha Zindal;Michael E Lee;Shaun M Lippow;Brian M Baynes - Nucleic acids research (2010)
  6. In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering. - Sean C Sleight;Bryan A Bartley;Jane A Lieviant;Herbert M Sauro - Nucleic acids research (2010)
  7. Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. - N Misawa;M Nakagawa;K Kobayashi;S Yamano;Y Izawa;K Nakamura;K Harashima - Journal of bacteriology (1990)
  8. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. - H Nielsen;J Engelbrecht;S Brunak;G von Heijne - Protein engineering (1997)
  9. Synthetic viruses: a new opportunity to understand and prevent viral disease. - Eckard Wimmer;Steffen Mueller;Terrence M Tumpey;Jeffery K Taubenberger - Nature biotechnology (2009)
  10. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. - Carola Engler;Romy Kandzia;Sylvestre Marillonnet - PloS one (2008)

引用本文的文献 ​

  1. Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning. - Robert Morbitzer;Janett Elsaesser;Jens Hausner;Thomas Lahaye - Nucleic acids research (2011)
  2. Assembly of designer TAL effectors by Golden Gate cloning. - Ernst Weber;Ramona Gruetzner;Stefan Werner;Carola Engler;Sylvestre Marillonnet - PloS one (2011)
  3. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. - Alejandro Sarrion-Perdigones;Erica Elvira Falconi;Sara I Zandalinas;Paloma Juárez;Asun Fernández-del-Carmen;Antonio Granell;Diego Orzaez - PloS one (2011)
  4. Reiterative Recombination for the in vivo assembly of libraries of multigene pathways. - Laura M Wingler;Virginia W Cornish - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2011)
  5. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. - Neville E Sanjana;Le Cong;Yang Zhou;Margaret M Cunniff;Guoping Feng;Feng Zhang - Nature protocols (2012)
  6. Tandem assembly of the epothilone biosynthetic gene cluster by in vitro site-specific recombination. - Lin Zhang;Guoping Zhao;Xiaoming Ding - Scientific reports (2011)
  7. High-throughput construction of intron-containing hairpin RNA vectors for RNAi in plants. - Pu Yan;Wentao Shen;XinZheng Gao;Xiaoying Li;Peng Zhou;Jun Duan - PloS one (2012)
  8. A rapid cloning method employing orthogonal end protection. - Arjen J Jakobi;Eric G Huizinga - PloS one (2012)
  9. The PLOS ONE synthetic biology collection: six years and counting. - Jean Peccoud;Mark Isalan - PloS one (2012)
  10. Precision editing of large animal genomes. - Wenfang Spring Tan;Daniel F Carlson;Mark W Walton;Scott C Fahrenkrug;Perry B Hackett - Advances in genetics (2012)

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